1. 새로운 질병 특이 표지 단백질의 발굴

Biological fluids, 즉 혈청(serum), 혈장(plasma), 뇨(urine), 흉수(pleural effusion), 안방수(aqueous humor) 등에서의 새로운 질병 특이 표지 단백질(바이오마커, biomarker)의 발굴은 임상에서 질병의 조기진단, 치료, 또 다른 질병과의 연관성을 예측하는 표지자로서 매우 중요한 의미를 갖는다. 현재까지 생체시료를 대상으로 하는 진단방법으로는 혈청학적 방법, 면역학적 방법, 이화학적 방법 또는 병리학적 방법 등을 주된 진단방법으로 하고 있다. 그러나, 현재의 질병 특이적인 표지 단백질은 질병의 단계를 정확하고 정밀하게 예측하기에 많은 한계를 가지고 있으며, 병리학적 검사를 위한 경우 검제 채취 과정에서 환자의 고통과 위험을 수반하는 경우가 많아 이에 따른 어려움이 따른다. 따라서, 비침습적이며 비교적 채취가 용이한 biological fluid, 특히 임상에서 쉽게 채취가 가능한 혈액은 질병 발생시나 특이적인 생리 상태에 있을 때 조직에 있던 단백질들이 순환기 계열로 분비(secretion)되면서 혈액에 과량으로 존재하기 때문에 질병의 진단 및 예후를 판정하기 위한 질병 표지 단백질의 발굴에 있어 매우 중요하게 평가되고 있다. 그러나 현재까지 새롭게 발굴된 표지단백질을 이용하여 임상에서 질병의 진단에 적용하고 있는 사례는 많지 않다. 기존의 단백질체학(proteomics) 법을 이용한 경우 검증이 어려운 한계가 있으며, 높은 재현성을 가진 것으로 알려진 면역학적 방법은 진단방법의 확립을 위하여 많은 비용과 오랜 시간이 걸린다는 단점이 있다. 따라서 보다 높은 재현성, 민감도, 특이성을 가진 새로운 분석방법의 개발은 매우 중요하다고 볼 수 있다.

2. 단백질체학 기법을 이용한 다양한 시료 전처리 방법

혈장에는 수십만개의 다양한 단백질들이 존재하는데, 그 중 10개 내외의 단백질이 전체 혈장 단백질의 90% 이상을 차지하고 있으며, 이는 주로 혈액 속에 낮은 농도로 존재하는 질병 특이적인 단백질들(e.g., prostate-specific antigen(PSA), carcinoembryonic antigen(CEA), alpha-fetoprotein(AFP) 등의 경우 ng/mL로 존재) 동정에 있어서 큰 방해요인이 된다. 따라서 이러한 시료의 분석 범위와 복잡성을 낮추기 위하여 여러 가지 방법들이 이용되고 있다. 먼저, 항체를 이용한 방법 중 가장 많이 사용되는 방법은 MARS(multiple affinity removal system)를 꼽을 수 있다. 이는 bead에 제거하고자 하는 단백질(e.g., albumin, transferrin, IgG, IgA, antitrypsin, hepatoglobin)에 대한 항원을 설치하여 항원-항체간의 친화성을 원리로 많은 양으로 존재하는 단백질들을 제거하는 방법이다. 또 다른 방법으로는 target peptide enrichment 방법을 들 수 있는데, 이는 생체 내의 신호전달에 관여하는 인산화 단백질이나 면역반응, 암의 생성에 관여한다고 알려진 당단백질을 분석할 때 주로 사용되고 있다. 당화(glycosylation)는 가장 중요한 번역 후 변형(post-translational modifications, PTMs) 중의 하나로 세포의 성장, 분열 및 면역 반응에 있어 세포 사이의 communication에서 중요한 역할을 하며 암의 진단, 예후 판정 및 질병의 진행 정도를 관찰함에 있어 중요한 의미를 갖는다고 알려져 있다. 따라서, 이러한 당단백질을 enrichment하기 위하여 lectin과 같인 당화펩타이드를 인지하는 물질을 이용해 당화펩타이드만을 선별적으로 결합시킨 뒤, PNGase F와 같은 탈당쇄효소로 탈당화(deglycosylation) 시켜서 당화펩타이드만을 bead에서 분리함으로써 당이 붙어있는 펩타이드의 선택적인 검출과 분석이 가능해졌다.

[그림 1] 당단백질과 당화펩타이드의 선택적인 분리/분석 방법

3. 질량분석기를 이용한 정량분석

특정 단백질의 발현 양이나 특수한 번역 후 변형과정(post-translational modifications, PTMs)을 정량적으로 이해하는 연구는 매우 중요한 의미를 갖는다. 이러한 정량분석은 새로운 질병 특이적인 표적 단백질을 찾는 과정에서도 매우 중요한 단계로 사용되는데, 특정 질병에서만 정량적으로 유의하게 변화하는 단백질을 잘 찾아내는 것이 우선적인 목표이기 때문이다. 현재 단백질체학(proteomics) 기법을 사용하여 표적 단백질을 정량하는데는 여러 가지 방법이 사용되고 있다. 내부표준물질의 labeling 방법으로는 ICAT(isotope-coded affinity technology), SILAC(stable isotope labeling by amino acids in cell culture), 18O-labeling, iTRAQ(isobaric tag for relative and absolute quantification) 등이 주로 사용되고 있으며, label-free 방법으로 표지 없이 해당 펩타이드의 스펙트럼 개수나 그 픽의 상대적 크기(intensity)를 비교하여 상대적으로 단백질의 양을 정량하는 방법도 널리 쓰여지고 있다.

[그림 2] 단백질의 정량분석을 위해 사용되는 질량분석기를 기반으로 한 여러 가지 방법

특히, 단백질은 시료의 양을 증폭하는 과정이 없기 때문에 소량의 양을 측정하기 위해서 AQUA(absolute quantification of proteins)와 같은 정량법이 개발되었다. 이러한 분석법은 시료 내에 존재하는 소량의 단백질을 정량분석할 수 있게 해주는데, 이는 임상 연구에서 충분한 양의 시료를 준비하기 어렵다는 점에서 적합한 방법이라고 볼 수 있다. AQUA는 표적 단백질에서 유도되는 펩타이드를 대상으로 동위원소로 치환된 펩타이드를 합성하고, 일정량을 내부표준물질(internal standard)로 첨가하여 그에 따른 상대적 크기로 정량분석하는 방법이다.

[그림 3] 단백질의 절대정량을 위해 사용되는 AQUA(absolute quantification of proteins) 방법

높은 민감도와 분해능을 가진 질량분석기(mass spectrometry)를 이용한 MRM(multiple reaction monitoring) 분석법 역시 널리 사용되는 방법이다. 이는 원하는 표적 단백질에 대한 펩타이드의 전구이온(precursor ion)과 그에 따른 몇 선택적인 딸이온(fragment ion)을 선택함으로써 복잡한 시료에서 선별적으로 정량을 수행할 수 있어 매우 특이적이고 선택적인 정량이 가능하다. 표준 펩타이드를 이용하여 전구이온의 m/z 값을 선택하고, 선택한 이온에 대하여 적절한 collision energy로 이들을 절편화(fragmentation)하여 그 중 가장 강한 신호를 나타내는 딸이온의 MS/MS 조건을 확립한 후에 얻어진 조건을 이용하여 원하는 펩타이드에 대한 분석법을 최적화 할 수 있게 된다.

이외에도 앞서 언급한 다양한 정량법들이 사용되고 있는데 이들을 응용하여 다양한 정량분석을 수행할 수 있다. 예를 들어, AQUA 방법과 MRM 분석법을 이용해 백혈병 환자의 myeloid 세포에서 만성골수백혈병(chronic cyelogenous leukemia, CML)의 발병과 예후에 중요한 역할을 하는 Bcr-Abl 혼성단백질을 정량분석할 수 있다. 돌연변이 Bcr-Abl 단백질의 정량분석을 위해 표준 펩타이드를 합성하고, 질량분석기를 사용하여 표준 펩타이드들이 질량분석기에서 어떠한 특성을 보이며, 분석을 위한 최적의 조건을 정립한다. 이 과정에서 MRM 분석을 위한 MS/MS 데이터를 선별해 모으게 되고, 앞서 선택한 최적의 분석조건을 기반으로 하여 실제 환자의 혈액이나 부분 정제된 myeloid 세포의 시료에서 Bcr-Abl 혼성단백질의 발현을 정량적으로 분석할 수 있다.

[그림 4] AQUA 펩타이드를 이용한 MRM 분석의 적용

이와 같이, 질량분석기의 민감도와 분석능이 크게 발전함에 따라 AQUA, MRM, SILAC과 같은 정량기법들도 한층 강력해졌으며, 이러한 방법을 기반으로 단백질들의 발현량과 아미노산의 변화를 자세하게 분석하는 것이 가능하게 되었다. 이런 실험을 이용하여 여러 질병에도 광범위하게 적용할 수 있으므로 각종 질병의 조기 진단과 질병의 치료에도 직접적으로 이용할 수 있을 것으로 기대된다.