1. 질량분석기를 이용한 PTM 분석

생체 내에서 일어나는 여러 작용들은 단백질에 의해서 조절된다. Central dogma 과정에서 번역(translation)이 끝난 후 단백질은 다양한 종류의 변형이 일어날 수 있는데 이를 단백질의 번역 후 변형(post-translational modification, PTMs) 이라고 한다. 현재까지 약 300개가 넘는 PTM들이 알려져 있으며, 이러한 PTM의 기능과 역할을 알아내는 것은 생체 내에서의 다양한 생명현상을 이해하는데 중요한 요소가 된다. 따라서 최근 질량분석기(mass spectrometry)를 이용한 단백질체학(proteomics) 에서는 이러한 PTM들을 동정하고 정량화하여 분석하는 것이 중요한 과제로 떠오르고 있다. 질량분석기에서의 PTM 분석은 PTM에 의해서 생기는 질량의 차이를 확인하는 것을 통해 이루어진다. 일반적으로 PTM이라 함은 단백질의 특정 아미노산 잔기에 각 변형에 따라서 특정 분자들이 추가되는 것을 의미하는데, 그렇기 때문에 PTM들이 일어난 단백질의 경우에는 추가된 PTM에 따른 분자만큼의 질량이 증가하게 된다. 이후 tandem mass spectrometry와 같은 분석법을 통하여 아미노산의 서열을 결정하면서 어느 위치에 PTM이 발생하였는지도 확인할 수 있게 된다.

[그림 1] 질량분석기를 이용한 PTM의 확인

2. 인산화 단백질의 분석

PTM의 한 종류인 인산화(phosphorylation)는 1955년 글리코겐(glycogen) 가인산분해효소(phosphorylase)의 기능이 밝혀진 이후로 세포 신호조절의 주요 원인 중 하나라고 인식되고 있다. 진핵세포 단백질 중의 30% 이상이 인산화가 일어날 수 있으며, kinase와 phosphatase에 의해 조절된다. 질량분석기를 이용한 인산화 단백질의 분석이 어려운 이유 중 하나는 바로 생체 내의 적은 양 때문이다. 그렇기 때문에 인산화 단백질 분석시에 농축(enrichment)하는 과정이 먼저 수행되야 한다. 농축방법으로는 크게 두 가지 방법이 주로 사용되고 있는데, 첫 번째는 IMAC(immobilized metal affinity chromatography) 방법으로 킬레이트 금속 이온인 Fe₃+ 이온과 인산기 PO₃¯ 사이의 결합력을 이용해 농축/분리를 수행한다. 두 번째는 TiO₂를 이용한 방법으로 IMAC과 유사하게 TiO₂와 인산기 사이의 bidentate 결합을 이용하여 인산화 단백질을 분리/농축할 수 있게 된다.

[그림 2] 대표적인 인산화 단백질 농축방법인 TiO₂와 IMAC

이렇게 농축된 인산화 단백질은 질량분석기를 이용하여 분석하게 되는데 인산화 단백질을 동정하는 것 이상으로 중요한 것이 바로 인산화 단백질의 정량이다. 하지만 앞에서 언급한 바와 같이 인산화 단백질의 경우 적은 양으로 존재하기 때문에 농축과정이 필요하고, 이 농축과 분리 과정에서 실험간의 차이와 시료들의 손실이 발생할 수 있어 정량적 어려움이 존재한다. 이러한 문제를 해결할 수 있는 정량방법으로 동위원소 표지방법(isotopic labeling)이 제시되었다. 대표적으로 SILAC(stable isotope labeling by amino acids in cell culture)을 생각할 수 있는데, 이는 아미노산의 구성성분인 탄소(C)와 질소(N)의 동위원소 13C, 15N을 이용하여 아미노산을 합성한 후 세포 배양시 동위원소 표지된 아미노산을 넣어줌으로써 동위원소로 표지된 단백질을 얻게 된다. 이렇게 표지된 단백질을 일반 단백질과 섞은 후 동시에 인산화 농축/분리를 수행해 준다. 이런식으로 동시에 농축/분리 과정을 진행함으로써 실험간의 차이를 줄일 수 있게 되며, 이후 질량분석기 분석에서 표지된 단백질과 표지되지 않은 일반 단백질의 질량값의 차이 그리고 신호의 세기를 사용하여 상대적인 정량까지도 수행할 수 있다.

[그림 3] SILAC(Stable Isotope Labeling by Amino acids in Cell culture)을 이용한 정량방법

3. 유비퀴틴화 단백질의 분석

유비퀴틴(ubiquitin)은 효모에서 인간에 이르기까지 모든 진행생물에서 발현되는 단백질이다. 76개의 아미노산으로 이루어진 작은 단백질로 다른 단백질에 공유결합이 되는 특성이 있으며 이를 가리켜 유비퀴틴화(ubiquitination)라고 부른다. 유비퀴틴화가 되는 기질 단백질은 매우 다양하며 세포 내의 거의 모든 생리활동 모두 연관이 있다고 볼 수 있다. 유비퀴틴은 그 그질로 유비퀴틴 스스로를 가지며, 이것은 공유결합으로 서로 연결된 유비퀴틴 사슬을 형성할 수 있게 된다. 유비퀴틴과 기질의 공유결합은 기질 분자의 lysine의 잔기(ε-amino group)와 유비퀴틴의 마지막 아미노산인 glycine의 카르복실 그룹이 유사 펩타이드 결합을 통해 일어나며, 이 결합에는 일련의 효소계(E1, E2, E3)가 관여하게 된다. 이들은 각각 유비퀴틴 활성화(ubiquitin activation, E1). 유비퀴틴 결합(ubiquitin conjugation, E2), 유비퀴틴 연결(ubiquitin ligase, E3)을 담당하고 있다. 단백질의 유비퀴틴화는 기질의 기능이나 생리활동에 많은 변화를 주는데, 가장 잘 알려진 기능으로는 유비퀴틴의 48번째 lysine을 통해 형성된 유비퀴틴 사슬에 의한 것으로 이들이 붙은 단백질은 단백질 분해효소 복합체인 26S 프로테아좀에 의해 인식되어 특이적으로 분해되고 유비퀴틴 단위체들은 재활용된다. 유비퀴틴에는 모두 7개의 lysine이 존재하며, 어떤 위치에 어떤 유비퀴틴화가 일어나느냐에 따라서 서로 다른 생리적 기능을 보인다. 유비퀴틴화는 거의 모든 세포 내의 기능에 관여하고 있다고 해도 과언이 아니다. DNA로부터 RNA를 거쳐 생성된 단백질들은 서로 다른 수명을 가지며 언젠가는 꼭 분해되는데 이때 대부분의 단백질의 수명은 유비퀴틴화에 의해 26S 프로테아좀에 인식되어 조절된다. 단백질 수명이 비정상적으로 변하면 다양한 질병을 유발하게되는데, 그렇기 때문에 단백질의 유비퀴틴화 과정에서 기질로 작용하는 단백질을 찾아내는 일은 질병의 원인 규명 및 치료제를 찾는 과정에서 매우 중요하다고 볼 수 있다.

[그림 4] 유비퀴틴화의 과정과 유비퀴틴 자리와 사슬에 따른 기능

유비퀴틴화 단백질 및 유비퀴틴화 위치는 일반적인 단백질체학의 분석법으로 찾을 수 있는데, 유비퀴틴은 C말단에 RGG(lysine-glycine-glycine) 서열을 가지므로 trypsin이나 arg-C와 같은 효소를 사용하면 유비퀴틴화 된 단백질의 펩타이드에 존재하는 lysine이 두 개의 glycine을 포함하게 된다. 이는 114.1 Da 만큼 질량의 증가를 가지게 되므로 이렇게 질량값이 증가한 펩타이드를 찾게 되면 어떤 펩타이드의 어떤 위치에 유비퀴틴화가 일어났는지 찾을 수 있다. 또한, 유비퀴틴 스스로도 유비퀴틴화가 일어나기 때문에 폴리유비퀴틴(polyubiquitin) 사슬도 찾아낼 수 있게 된다.

[그림 5] Trypsin으로 펩타이드화한 뒤 질량분석기를 이용한 유비퀴틴화 단백질 분석

4. 또 다른 단백질의 번역 후 변형 분석

앞서 언급한 인산화와 유비퀴틴화 이외에도 다양한 번역 후 변형들이 존재한다. 가장 많이 알려진 것으로는 아세틸화(acetylation), 당화(glycosylation), 메틸화 (methylation), 질산화(nitration), 수모화(SUMOylation) 등이 있으며 여러 가지 연구가 진행중이다. 우리 연구실에서는 현재 위에서 언급한 인산화, 유비퀴틴화 외에도 아세틸화, 질산화 등을 분석하고 있으며, 특히 최근에 보고된 바 있는 SEPTM(serial enrichments of different post-translational modifications) 방법을 응용해 몇 가지의 변형들을 분석하고 있다. (질산화 분석에 관한 내용은 "질산화 단백질 분석" 페이지에 자세히 언급되어 있다)